在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。

近年来，紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用，它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析，而且还可以用于某些物质含量的测定。

分光光谱技术可用于：

1) 通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。
2) 通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或与其他物质混合存在的一种物质的含量。
3) 通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，追踪反应过程。

一、紫外及可见光分光光度法

这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术，应用十分广泛。其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值，而比色计则是一种较简单的测量仪器，其原理是利用虑光片来测量较宽波段（如可见光中的绿光、红光或蓝光范围）的吸收值。

光吸收法则：

溶液对光的吸收有两个基本法则：

1) 透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目（即溶质浓度[C]）呈指数相关。
2) 透过溶液的光的吸收值同透过吸收溶液的路径长度l成指数相关。

这两条法则包括在比尔－朗伯关系式中。通常以入射光（Io）和出射光（I）的光密度来表示：
Log10(Io/I)=εl[C]

其中ε对于吸收物质及波长是一个常数，称为吸光系数或吸收系数，[C]的单位为mol/L或g/L，l的单位为ml。这一公式非常有用，因为大多数分光光度计设计为直接测量log10(Io/I)的值（A）或消光值（E）（旧教材中可能使用以废除的术语：光密度）。对于遵循比尔－朗伯关系的物质，A与C呈线性关系。吸收值常用下标表示其波长，如A550表示550nm处的吸收值。透过溶液的光的比例称为透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。

吸收值（A）（absorbance）——由公式得出：A= Log10(Io/I)
透光率（T）（transmittance）——通常以百分数表示：T=(I/Io)×100%.

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