高效液相色谱法

高效液相色谱法 附录Ⅵ D. 高效液相色谱法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、 缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内， 在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1.对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的 规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为 常用,辛基硅烷键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂，用于离 子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂，用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为 室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法（附录Ⅳ Ａ）项下对溶 剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改 变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各 组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以适应具体品种并达 到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调 整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和 拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定 的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟 或长度计，下同,但应取相同单位）和半峰高宽(W),按n=5.54(tR／W) 计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改 变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要 求。 (2) 分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有 较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： 2(tR-tR) R＝────────── W＋W 式中 tR为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR为相邻两峰中前一峰的保留时间； W及W为此相邻两峰的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.5。 (3) 重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积 测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液,分别进样 3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 (4) 拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾 因子(T)是否符合各品种项下的规定,或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖 尾因子计算公式为： W T＝────── 2d 式中 W为0.05峰高处的峰宽； d为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外，T应在0.95～1.05间。 3.测定法 定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时， 须采用峰面积法。 (1) 内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定,精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量 取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对 照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： A／C 校正因子（f）＝─────── A／C 式中 A为内标物质的峰面积或峰高； A为对照品的峰面积或峰高； C为内标物质的浓度； C为对照品的浓度。 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品 中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： A 含量(C)＝f·─────── A／C 式中 A为供试品（或其杂质）峰面积或峰高； C为供试品（或其杂质）的浓度。 f、A和C的意义同上。 当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物 质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。 (2) 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定 量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式 计算含量： A 含量(C)＝C×──── A 式中各符号意义同上。 (3) 加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品 种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校 正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可 直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。 测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度 相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量 （以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%～25%或其峰面 积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值的10%）。然后，取供试品溶液和对 照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外,应为主成分保留时间的 若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照 溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。 (4) 不加校正因子的主成分自身对照法 当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配 制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记 录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质 的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图 Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减 去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。 (5) 面积归一化法 由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含 量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图 上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，即得。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量 时，以定量环进样为好。