补充资料：光学显微镜制片技术

    　　将生物材料制成适于在光学显微镜下观察的薄片的技术。新鲜的生物材料虽然用简单的方法做成临时制片也可观察，但为了保存以备以后的观察，常需按一定步骤制成永久制片。
　　
　　显微制片首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免膺像、变形和失真,因此须将生物材料做固定处理;制片必须薄而透明，才能在光学显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。
　　
　　显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4大类。
　　
　　切片法 　光学显微镜的切片厚度在 2～25微米之间，一般动植物材料的切片以厚10微米左右为合适。切片法根据包埋剂的不同而有所不同。最常用的是石蜡切片法，它适用于一般生物材料。棉胶切片法，把生物材料经棉胶包埋后切片。适用于特别坚硬的材料或特别柔软而体积大的材料（如完整的大脑）。冰冻切片法，将生物材料在一定的介质中冰冻固化后切片。适用于研究活体标本或作组织化学的研究。乙二醇甲基丙烯酸脂法（简称GMA法）,适用于制作1～3微米厚的切片。石蜡切片法包括固定、包埋、切片、染色、脱水和封固等步骤。关键是把生物材料用石蜡包埋，以石蜡为支持物，把浸在蜡块中的生物材料切成理想的薄片。操作过程为：固定→水洗→从低浓度逐级到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→二甲苯脱蜡→逐级从高浓度到低浓度酒精处理，最后过渡到水→染色→逐级从低浓度到高浓度酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封固。其中的基本步骤在各种制片技术中都是相同的。
　　
　　固定 　用物理的或化学的方法将生物材料迅速杀死、使蛋白质变性和凝固，达到保持细胞的形状和内部结构的目的。物理固定法常用冷冻处理或火焰烘烤。化学固定法，主要是把生物材料迅速浸泡在固定剂中。固定剂常是含有几种化合物的混合液，既有强烈凝固蛋白质的化合物，也有非凝固性的化合物，它们对蛋白质起交联和稳定作用，即所谓"鞣化作用"。已有的一些比较理想的固定剂,大多以最初设计者命名（表1）。
　　
　　
　　脱水和透明 　固定之后，一般须用水冲洗材料移去多余的固定液。为了使材料能为石蜡所浸透，必须将水移去，换成能溶解石蜡的有机溶剂，如二甲苯等。在制片中常用的脱水剂是乙醇（酒精），将浸在水中的材料依次移入从低浓度到高浓度的乙醇中，最后移到纯乙醇中完成脱水。然后将脱水后的材料移入二甲苯中。
　　
　　浸透和包埋 　在温箱中用溶化的石蜡取代二甲苯。使材料逐步为纯石蜡所浸透，然后将材料连同熔化的石蜡，倒入小纸盒中，在室温下或在冷水中使包埋有材料的蜡块迅速凝固。浸透和包埋的目的是使材料藉石蜡的支持能被切成薄片。
　　
　　切片 　将包埋好的材料用切片机切成薄片。切片机有轮转式切片机（图1）和滑行式切片机（图2）两种。切片机一般用专门的钢刀。　　包埋材料的蜡块边缘要整齐，使被切下的蜡片前后能自然地连接，形成蜡带，有利于制备连续切片。切片后，将蜡带或单个蜡片贴在载玻片上。
　　
　　染色 　先将已粘贴有蜡片或蜡带的载玻片，在染色缸中经二甲苯脱蜡，再经过一系列从高浓度到低浓度的酒精而过渡到水中，即可染色。生物染料种类繁多，用途各异，可区分为碱性染料和酸性染料两大类。碱性染料为一种色碱盐，可染细胞核，如苏木精、甲基绿和番红等。酸性染料为一种色酸盐，可染细胞质或核以外的其他成分,如伊红、橘红G和固绿等。碱性染料和酸性染料混合后称中性染料，也称复合染料，如芮氏染色剂和姬姆萨染色剂等。染色可只用一种染料，但通常采用复染，例如：先染碱性染料显示核，再染酸性染料显示其他结构。染色的深浅，随材料的不同和浸染时间的长短而不同，因此要达到合适的程度常需要进行分色，即先过度染色,再使其褪色,当达到合适的程度后即中止。显微制片中采用何种染色方法，需根据材料和目的来选择（表2）。
　　
　　
　　上述染色方法都是用于经固定而被杀死的材料，在研究生活状态的生物材料或鉴定细胞的活性时，则用活体染色法。活体染色需用无毒性的活体染料，并能使特异的细胞结构着色。例如：中性红可以显示活细胞的液泡而詹纳斯绿可以显示线粒体等。
　　
　　封固 　染色之后一般都要用封固剂和盖玻片把材料封固起来。只有像血液、细菌等需用油浸镜观察的制片才可不加盖玻片。封固剂应有较高的折射率和固化后不易碎裂的特点，常用的封固剂是加拿大树脂。
　　
　　整体封片法 　用于单细胞、微小生物体或分散的器官的整装制片方法。此法也需要经过固定、染色、脱水、透明和封固各个步聚。材料常用洋红。代氏苏木精等单一染色法，但也可复染。整体封片法中常用冬青油、丁香油一类香精油作为透明剂，以代替二甲苯，这样可避免标本脆裂，较厚的标本在封固时，要在盖玻片下垫以适当大小的碎玻璃或玻璃丝以免压坏。
　　
　　涂片法 　把易于分散的生物标本涂布在载玻片上的制片方法。此法的永久制片需经固定、染色，脱水等步聚，适用于细菌、血液、花粉母细胞和精子等细小而分散的材料。血液涂片便是一例。
　　
　　压片法 　将天然的、易于分散的组织或经过处理后易于分散的组织，如动物的精母细胞、果蝇的唾液腺、植物的花粉母细胞和根尖细胞等放在载玻片上、再加盖玻片，用力压碎组织，使细胞或细胞内的结构铺展成一层的制片方法。压片法常用于观察染色体，通常用醋酸洋红、地衣红和石炭酸复红染色。
　　
　　

参考书目
　　　芮菊生等：《组织切片技术》，人民教育出版社，上海，1980。
　　　李正理：《植物制片技术》,科学出版社,北京，1982。
　　　朱澂：《植物染色体及染色体技术》,科学出版社,北京，1982。
　　

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