工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

限制性内切酶有ⅰ型和ⅱ型限制性dna内切酶之分，ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开dna双链。故通常所指都是ⅱ型限制性dna内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－oh和5′－p末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg dna/2-5单位酶）等反应条件。

连接酶有t4噬菌体dna连接酶、t4噬菌体rna连接酶、大肠埃希菌dna连接酶等。dna连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有mg2+和atp存在，ph7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接dna 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

聚合酶有dna聚合酶（以dna为模板合成dna大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ，大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ大片段（klenow大片段），t4或t7噬菌体dna聚合酶等）；rna聚合酶（以dna为模板合成rna，t7或t3噬菌体rna聚合酶）；逆转录酶（以rna为模板合成dna，除rna病毒中发现外，发现大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ和taq dna聚合酶都有逆转录活性）。

大肠杆菌dna聚合酶ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。klenow片段是dna聚合酶ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（nick translation）法标记核酸，也可用于dna序列测定，修补dna链等。

核酸酶有dnase、rnase、核酸酶s1等，可水解相应的dna和rna，核酸酶s1可降解单链dna和rna，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cdna合成中产生的发夹环。

末端转移酶在mg2+存在下，选择3′－oh端单链dna为引物加成核苷酸，在co2+存在下，选择3′－oh端双链dna为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

碱性磷酸酶去除5′－p，可防止二分子dna片段5′端p基团自身空间障碍，影响dna分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体dna除去5′端p基团，在连接酶作用下目的基因的5′端p先与载体3′端oh连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率。