无菌检查法

无菌检查法 附录ⅩⅢ B. 无菌检查法 无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查 的其他品种是否无菌的一种方法。 无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作， 防止微生物污染。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验证。 生物制品的无菌检查，应按《中国生物制品规程》中有关无菌检查的规定办理。 培养基及其制备方法 培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该 处方生产的符合规定的脱水培养基。以下培养基制备时，均以115℃灭菌30分钟。 1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐流体培养基) 酪胨（胰酶水解） 15g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5g 新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml L－胱氨酸 0.5g (或新配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml) 硫乙醇酸钠 0.5g 琼酯 0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH为弱碱性， 煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装， 灭菌。 在供试品接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则, 须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。 2.霉菌培养基 胨 5g 磷酸氢二钾 1g 酵母浸出粉 2g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20g 水 1000ml 除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH值约为6.8，煮沸,加葡萄 糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 3.选择性培养基 (1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查) 照上述需气菌、厌气菌培 养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀，分装，灭 菌。 (2) 聚山梨酯80培养基(用于油剂药品的无菌检查) 照上述需气菌、厌气菌培养基 及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80，摇匀，分装，灭菌。 4.营养肉汤培养基 胨 10g 肉浸液 1000ml 氯化钠 5g 取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH 值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5.营养琼脂培养基 照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2 ±0.2，分装，灭菌。 6.0.5％葡萄糖肉汤培养基 胨 10g 葡萄糖 5g 氯化钠 5g 肉浸液 1000ml 取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解 后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，灭菌。 7.真菌琼脂培养基 照真菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分 装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。 上述培养基分别按15ml与40ml或需要量分装于试管或其他容器中，装量约为试管或 容器高度的2/5，按规定的温度和时间灭菌。细菌培养基经30～35℃培养48小时,真菌培 养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。

肉浸液制备法 取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1000g 加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补 足液量，分装，灭菌，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代 替。 培养基质量应通过灵敏度检查。 培养基灵敏度检查法 1.菌种 (1)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)[CMCC(B)28 001] (2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64 941] (3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001] 2.操作 (1) 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面 的新鲜培养物，分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液； 将生孢梭菌的不含琼 脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸至无菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用 0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。分别取上述菌悬液，用0.9％无菌氯化钠溶液 稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10～100个菌 并计数。 (2) 取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的 真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10 ～100个菌并计数。 将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气 菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装 量为12ml的需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml， 接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养 5天并逐日记录结果。 3.结果判定 以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏 度检查符合要求。 对照用菌液 1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌液 取金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内,在30～35℃培养 16～18小时后，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。 2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液 取生孢梭菌[CMCC(B)64 941]的需气 菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小 时后，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。 3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液 取白色念珠菌[CMCC(F)98 001]的真菌琼 脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至真菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用 0.9％无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。 抑细菌和抑真菌试验 在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用。 用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白 色念珠菌均10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定的温度， 培养3～5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加供试品 的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判为 供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和法、薄膜过滤法 处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。 检查法 无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者 适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。 操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌的 方法取内容物。 凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。 1. 直接接种法 (1) 供试品准备 供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 按表1或表2规定量取供试品，混合。 表1 出厂产品检验量 ───────────┬────────┬──────── 产 品 │每批产品数量/个 │最低检验量 ───────────┼────────┼──────── 注射剂 │ ＜ 100 │10%或最少4个 │ 100～150 │ 10瓶（个） │ ＞500 │2%或最多20个 │ ＜200 │5%或最少2个 眼用及其他非注射产品 │ ≥200 │ 10个 │ ≤4 │每个容器 桶装固体原料 │ 5～50 │20%或最少4个 │ ＞50 │2%或最少10个 ───────────┴────────┴──────── 供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料， 按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液，或该药品项下规定的 溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。 供试品如为外科敷料，取供试品4个包装，以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪 取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11 股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。 供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以 浸没供试品的适量培养基中。或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁(输血、输 液袋)，收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。 供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭 活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。每 管接种量为0.2ml。 (2) 操作 取上述备妥的供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气 菌培养基6管，其中`1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照，另接种于真菌 培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合，需气菌、厌气菌培养基管置30～50℃、 真菌培养基管置20～25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对 照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从 外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上 继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接 种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。 2. 薄膜过滤法 如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中,混合后，通过装有孔径不大于 0.45μm 的薄膜过滤器，然后用0.9％无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对 照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基及阳性对照管用培养基分别加至薄 膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培养基中，按规 定温度和时装培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(抗细菌药物，以 金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念 珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养24～72小时有菌生长。 结果判断 当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时,可根据观察所得的结果判定： 如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供 试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新取 2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供 试品不合格。 表2 上市抽验样品检验量 ───────────┬───────┬──────┬───────┬───────── ─ 供试品装量 │每管接种量/ml │直接接种法 │薄膜过滤法接种│取供试品 数/瓶(或支) │ │培养基量/ml │培养基量/ ml │ ───────────┼───────┼──────┼───────┼───────── ─ 1ml以下或1ml │ 全量 │ 15 │ │ 11 2ml至5ml以下 │ 半量 │ 15 │ │ 11 5ml至20ml以下 │ 2 │ 15 │ │ 11 20ml至50ml以下 │ 5 │ 40 │ │ 11 50ml至100ml以下(静脉) │ 全量 │ — │ 100 │ 5 100ml至500ml │ 全量 │ — │ 100 │ 5 500ml以上 │ 500 │ — │ 100 │ 5 无菌粉针剂 │ │ │ │ 11 无菌粉末原料 │ │ │ │6份，各0.5g ───────────┴───────┴──────┴───────┴───────── ─ 表3 抗生素类药品上市抽验样品检验量 ───────────┬──────────────┬───────── │薄膜过滤法接种培养基量/ml │ 供试品装量 │──────────────│取供试品数/支 │封闭式过滤器 │薄膜过滤器l │ ───────────┼───────┼──────┼───────── 2ml以下 │ 100 │ 50 │ 6 2ml至5ml以下 │ 100 │ 50 │ 6 5ml至50ml以下 │ 100 │ 50 │ 6 50ml以上 │ 100 │ 50 │ 6 无菌粉针剂 │ 100 │ 50 │ 6 无菌粉末原料 │ 100 │ 50 │ 6份，各0.5g ───────────┴───────┴──────┴─────────