微生物限度检查法

微生物限度检查法 附录ⅩⅢ C. 微生物限度检查法 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检 查方法。包括染菌量及控制菌的检查。 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。 检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25 ～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃ 。 检验结果的报告以1g、1ml或10cm为单位。 培养基及其制备方法 除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。 1 、营养琼脂培养基与营养肉汤培养基 见无菌检查法（附录ⅩⅢ Ｂ） 2 、玫瑰红钠琼脂培养基 胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10g 琼脂 15～20g 磷酸二氢钾 1g 水 1000ml 硫酸镁 0.5g 除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、玫瑰 红钠，分装，灭菌。 3 、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD) 胨 10g 琼脂 15～20g 酵母浸出粉 5g 水 1000ml 葡萄糖 20g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。 4 、胆盐乳糖培养基(BL) 胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5g 牛胆盐（或去氧胆酸钠0.5g） 2g 氯化钠 5g 水 1000ml 磷酸氢二钾 4.0g 除乳糖、牛胆盐外，取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。 5 、曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB) 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20％乳糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它3 种溶液, 摇匀，倾注平皿。 6 、麦康凯琼脂培养基(MacC) 胨 20g 1％中性红指示液 3ml 乳糖 10g 琼脂 15～20g 牛胆盐 5g 水 1000ml 氯化钠 5g 除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合，加热使溶解，调节pH值使 灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌， 冷至约60℃，倾注平皿。 7、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,MUG)培养基 胨 10g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸铵 5g 磷酸氢二钠（无水） 6.2g 硫酸锰 0.5mg 亚硫酸钠 40mg 硫酸锌 0.5mg 去氧胆酸钠 1g 硫酸镁 0.1g MUG 75mg 氯化钠 10g 水 1000ml 氯化钙 50mg 除MUG外，各成分溶解于1000ml水中，调节PH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶 解后，每管分装5ml，115℃灭菌20分钟。 8 、三糖铁琼脂培养基(TSI) 胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10g 0.2％酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10g 琼脂 12～15g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化钠 5g 除三糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3 ±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装,灭菌，制成高底层(2～ 3cm)短斜面。 9 、四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB) 胨 5g 硫代硫酸钠 30g 牛胆盐 1g 水 1000ml 硫酸钙 10g 取上述成分，混合，微温使溶解，灭菌。 临用前，取上述培养基，每10ml加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中)0.2ml 和亮绿试液0.1ml ，混匀。 10 、沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS) 胨 5g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5g 中性红指示液 2.5ml 乳糖 10g 亮绿试液 0.33ml 牛胆盐 8.5g 琼脂 20g 枸橼酸钠 8.5g 水 1000ml 枸橼酸铁铵 1g 除乳糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2 ±0.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，灭菌，冷至60℃，倾注 平皿。 11、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL) 胨 20g 枸橼酸钠 1g 牛肉浸出粉 3g 枸橼酸铁铵 1g 乳糖 10g 中性红指示液 3ml 蔗糖 10g 琼脂 18～20g 去氧胆酸钠 1g 水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g 除糖、指示液及琼脂外,取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1， 加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分，摇匀，冷至60℃，倾注平皿。 12、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 胨 10g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g 氯化钠 5g 水 1000ml 除琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂， 加热溶化后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。 13、亚碲酸盐肉汤培养基 临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠（钾）试液0.2ml， 混匀，即得。 14、卵黄氯化钠琼脂培养基 胨 6g 10％氯化钠卵黄液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 琼脂 23g 氯化钠 30g 水 650ml 除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1，灭 菌，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液,充分振摇，倾注平皿。 10％氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出卵黄，放入10％灭菌氯化钠 溶液100ml中，充分振摇，即得。 15、甘露醇氯化钠琼脂培养基 胨 10g 酚磺酞指示液 2.5ml 牛肉浸出粉 1g 琼脂 15～20g 甘露醇 10g 水 1000ml 氯化钠 75g 除甘露醇、指示液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2， 加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60℃,倾注平皿。 16、蛋白胨水培养基 胰蛋白胨 10g 水 1000ml 氯化钠 5g 取上述成分，混合，加热溶化，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管,灭菌。 17、磷酸盐葡萄糖胨水培养基 胨 7g 磷酸氢二钾 3.8g 葡萄糖 5g 水 1000ml 取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，121℃， 灭菌15分钟。 18、枸橼酸盐培养基 氯化钠 5g 枸橼酸钠（无水） 2g 硫酸镁 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 20ml 磷酸氢二钾 1.0g 琼脂 15～20g 磷酸二氢铵 1g 水 1000ml 除指示液和琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1，加 入琼脂，加热溶化，加入指示剂，混匀，分装于小试管，灭菌，置成斜面。 注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。 19、糖、醇发酵培养基 基础液 胨 10g 0.5％酸性品红指示液 10ml 糖、醇 0.5％ （或溴麝香草酚蓝指示液6ml ） 氯化钠 5g 水 1000ml 取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示液，混匀,分装 每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。 配制葡萄糖发酵培养基时，于100ml基础液加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的 小试管中，121℃灭菌15分钟。配制其他糖、醇发酵培养基时,将各种糖、醇分别配成10％溶 液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖、醇溶液加入100ml基础液内,分装 于灭菌小试管中。 注：糖、醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。 20、脲（尿素）琼脂培养基 胨 1g 0.2％酚磺酞指示液 6ml 葡萄糖 1g 20％无菌脲溶液 100ml 氯化钠 5g 琼脂 20g 磷酸二氢钾 2g 水 1000ml 除脲和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化 并分装于锥型瓶，灭菌，冷至50～55℃,加入无菌脲溶液，混匀，分装于灭菌试管中，置成斜面。 21、氰化钾培养基 胨 3g 磷酸氢二钠 5.64g 氯化钠 5g 氰化钾试液 15ml 碳酸二氢钾 0.225g 水 1000ml 除氰化钾试液外，取上述成分，混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，灭菌，冷却后，加入 氰化钾试液，分装于12mm×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡胶塞塞紧，置4℃保存。 同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。 22、赖氨酸脱羧酶试验培养基 胨 5g 1.6％溴甲酚紫指示液 1ml 酵母浸出粉 3g L-赖氨酸(DL-赖氨酸) 0.5(1)g 葡萄糖 1g 水 1000ml 除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后，加入L-赖氨酸（DL-赖氨酸），调节pH值使 灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内，每管2.5ml并滴加一 层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。 23、绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基（PDP琼脂） 胨 20g 甘油 10ml 氯化镁（无水） 1.4g 琼脂 18～20g 硫酸钾（无水） 10g 水 1000ml 取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及 琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。 24、明胶培养基 胨 5g 明胶 120g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1， 分装于小试管，灭菌。 25、硝酸盐胨水培养基 胨 10g 亚硝酸钠 0.5g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 硝酸钾 2g 取胨和酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝 酸钠溶解，混匀，分装于含杜氏管的小试管，灭菌。 试药 牛肉浸出粉 Beef extract powder 本品为米色粉末，在水中溶解。 牛胆盐 Ox bile salt 本品为淡黄色或黄棕色粉末，味苦而甜，具吸湿性，在水和醇中易溶。 玫瑰红钠（四氯四碘荧光素钠） Rose bengal [C20H2Cl4Na2O5=1017.6] 本品为棕红色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕 色。 枸橼酸铁铵 Ammonium ferric citrate [C12H22FeN3O14=488.16] 本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶解，在醇 和醚中不溶。 胰蛋白胨 Tryptone 本品为米黄色粉末，在水中溶解。 液状石蜡 Paraffin liquid 本品为无色油状液体。在水和醇中不溶，能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油类 相混溶。 DL-赖氨酸 DL-Lysine [C6H14N2O2＝146.19] 本品为白色结晶，极易潮解。在水中溶解。 L-赖氨酸 L-Lysine [C6H14N2O2=146.19] 本品为白色针状结晶，在空气中易吸收二氧化碳。在水中易溶，在醇中微溶，在醚 中不溶。 酸性品红 Fuchsin acid [C20H17N3Na2O9S3=585.54] 本品为绿色有金属光泽的颗粒或深红色粉末。在水中溶解，在醇中不溶。 磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate [NH4H2PO4=115.03] 本品为无色结晶或白色结晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。 试液 二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需 新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。 无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的带塞试管中，121℃ 灭菌20分钟。 亚碲酸钠（钾）试液 取亚碲酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使 溶解。 玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠试液0.1g，加水使溶解成75ml。 无菌枸橼酸钠－氯化钠试液 取枸橼酸钠0.5g，加0.9％氯化钠溶液10ml，121℃灭 菌20分钟。 草酸铵试液 取草酸铵1g，加水使溶解成100ml。 亮绿试液 取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。 氢氧化钾试液 取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。 盐酸试液 取盐酸8.4ml，加水稀释成100ml。 α-萘酚乙醇试液 取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。 氰化钾试液 取氰化钾0.5g，加水溶解使成100ml。 氯化三苯四氮唑试液 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使 完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或 取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml 徐徐滴入。 稀释剂 0.9％无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。 无菌聚山梨酯80－氯化钠溶液 取1ml聚山梨酯80，加0.9％氯化钠溶液使成100ml,121 ℃灭菌20分钟。 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000 ml，121℃灭菌20分钟。 指示液 中性红指示液 取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。 变色范围 pH6.8～8.0（红→黄）。 甲基红指示液 取甲基红0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。 亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。 酚磺酞指示液 取亚甲蓝0.5g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。 变色范围 PH6.8～8.4（黄→红）。 溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇溶解使成100ml。 变色范围 pH5.2～6.8（黄→紫）。 溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加 水至100ml。 变色范围 pH6.0～7.6（黄→蓝）。 酸性品红指示液 取酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液 16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第2滴,直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟， 再静置2小时，滤过，即得。 变色范围 pH 6.0～7.4（黄→红）。 曙红钠指示液 取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。 供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g 或10ml 。化学膜剂为100cm,贵重的或微量包装的供试 品检验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。 供试品须取自2 个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂除须取自2 个以上的包装单位外，应 取自4 丸（片）以上样品。 供试液的制备 按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 1 、液体供试品 取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适 量聚山梨酯80；气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当于10g 或10ml供试品，再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可 用供试品作为供试液。 2 、固体、半固体或黏稠液供试品 称取供试品10g,置0.9％无菌氯化钠溶液100ml中，用 匀浆仪或其他适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80， 并适当加温，但不应超过45℃。 (1)非水溶性供试品 取供试品5g(5ml)，加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、 聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9％无菌氯化 钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。 (2)不溶于水的膜剂供试品 取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸 泡，振摇，作为供试液。 (3)肠溶胶囊（片）供试品 称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶 内，于45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。 3、含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。 (1) 稀释法 将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的 浓度。 (2) 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心(每分钟3000转)30分钟，弃去上清 液，留底部集菌液约2ml ，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(每 分钟500转)5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。 (3) 薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中,摇匀，以无菌操作加入装 有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后,用稀 释剂冲洗滤膜3次，每次50～100ml，取出滤膜备检。 (4) 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因 子，中和毒性后制成供试液。 对照用菌液 控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌[CMCC(B)44 102]、 沙门菌〔CMCC(B)50 094〕、铜绿假单胞〔CMCC(B)10 104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕。 取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内， 培养18～20小时后，稀释至1:10。 对照菌的加入量为50～100 个。 检查法 1 、细菌、霉菌与酵母菌计数 (1) 平皿菌落计数法 取均匀供试液,进一步稀释成1:10 、1:10等适宜的稀 释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃ 的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2～3个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下， 前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼 脂培养基用于酵母菌计数。合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养 基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计 霉菌菌落数及酵母菌菌落数。 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细 菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。 细菌培养时间为48小时,分别在24小时及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为 准，霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时 菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。 点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌 落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30～300(30～ 100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30～300(30 ～100)之间时，按下式计算两级比值。 高稀释级的平均菌落数×稀释倍数 比值＝──────────────── 低稀释级的平均菌落数×稀释倍数 当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级的平均菌落数乘 以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时,以后2个稀释级 计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的 稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最 高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最 低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10（或1:100 ）稀释级平均菌落数等于 或大于原液（或1:10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。 (2) 培养基稀释法 取供试液（原液或1:10、1:100供试液）3份，每份各1ml,分别 注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后 ，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和，即为每1ml的菌落数,共得3组数 据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。 如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为 小于10个。 2 、控制菌检查 除另有规定外，取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml 、10cm), 直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等 项检查。 (1) 大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加 入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50～100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量 的稀释液作阴性对照。培养18～24小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。 取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时 时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现 荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基 质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。 当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明 无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性， 靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。 如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基 培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18～24小时，如上述供试液 培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选2～3可疑菌 落作靛基质试验(Ⅰ)、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）、枸橼酸盐利 用试验（C）及革兰染色、镜检，按表1规定判断结果。 靛基质试验(Ⅰ) 取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小 时,沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。 甲基红试验（M） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中, 培养48小时±2小时，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳 性，呈黄色为阴性。 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P ） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖 胨水培养基中，培养48小时±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀， 再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴 性。 枸橼酸盐利用试验（C） 取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面 上，一般培养48～72小时,培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培 养基颜色无改变为阴性。 结果判断见表1。对与MUG-1反应不符的可疑菌株（见注①、②），应重新分离培养， 再作生化试验证实。 表1 MUG的结果判断 ─────┬────────┬───────┬───────── MUG-1 │曙红亚甲蓝琼脂 │ IMVic │ 结 果 ─────┼────────┼───────┼───────── + + │ │ │ 检出大肠杆菌 - - │ │ │ 未检出大肠杆菌 + - │ 无菌生长 │ │ 未检出大肠杆菌 + - │ 有菌生长 │ - + - - ① │ 检出大肠杆菌③ - + │ 有菌生长 │ + + - - ② │ 检出大肠杆菌③ ─────┴────────┴───────┴───────── 注：①、②如①出现+ + - -或②出现阶段- + - -，均应重新分离菌株，再作MUG-Ⅰ和 IMVic试验。 ③革兰阴性杆菌。 (2) 沙门菌(Salmonella apecies) 取营养肉汤培养基3份，每份100ml,2份分别加 入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释 液作阴性对照。培养18～24小时，阴性对照应无菌生长。取其余2份培养物各1ml，分别 接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18～24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂 （或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上， 培养18～24小时或延至40～48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板 无菌落生长，或有菌落但不同于表2所列特征时，可判为未检出沙门菌。 如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者，均应挑选2 ～3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基,培养18～ 24小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑似菌斜 面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌。否则，应继续做以下试验。 表2 沙门菌菌落形态特征 ───────┬──────────────────────────── 培 养 基 │ 菌 落 形 态 ───────┼──────────────────────────── 胆盐硫乳琼脂 │无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 ───────┼──────────────────────────── 沙门、志贺 │无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色 菌属琼脂 │ ───────┼──────────────────────────── 曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 ───────┼──────────────────────────── 麦康凯琼脂 │无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 ───────┴──────────────────────────── 靛基质试验 照大肠杆菌项下操作并判断结果。 脲酶试验 取疑似菌斜面培养物接种于脲琼脂培养基斜面，培养24小时，斜面变为 红色为阳性，不变色为阴性。 氰化钾试验 取培养20～24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳沾取1 环，接种至对照培养基及氰化钾培养基，立即以橡胶塞塞紧，培养24～48小时，对照管 应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长为阴性。 赖氨酸脱羧酶试验 取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培 养基，培养24～48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。 动力检查 取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24小时， 细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保留2～3 天后，再判断。 血清凝集试验 在洁净载玻片一端，以白金耳沾取沙门菌属A～F“0” 多价血清2 ～3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动,如出现凝集现象, 应以0.9％氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有 反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。仍未出现凝集时，应取 斜面培养物，置含少量0.9％氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温 30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。 上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，脲酶阴性,氰化 钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力阳性，A～F“0” 多价血清凝集试验阳性。各鉴定结 果按表3判定。 表3 沙门菌检查结果判定 ──┬─────────────────┬────┬───────── 序│ 血清凝集试验 │ │ │ (A～F“0” 血清) │ │ ├──┬───────┬──────┤生化试验│ 结 果 │凝集│ 100℃30分钟 │0.9％氯化钠 │ │ 号│反应│ 凝集反应 │溶液对照 │ │ ──┼──┼───────┼──────┼────┼───────── 1 │阳性│ │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门菌 2 │阴性│ 阳 性 │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门菌 3 │阴性│ 阴 性 │ │ 不符合│未检出沙门菌 ──┴──┴───────┴──────┴────┴───────── 上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。 (3) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml， 2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液 等量的稀释液作阴性对照。培养18～24小时，阴性对照应无菌生长,其余2份培养液划线 接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养18～24小时。当阳性对照的平板呈 现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有 蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2～3个菌落，分别接种于营 养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取培养物革兰染色，并做氧化酶试验。 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养 物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内呈粉红色逐 渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。 如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出铜绿假单胞菌。 否则，应进行绿脓菌素试验。 绿脓菌素(Pyocyanin) 试验 取上述琼脂培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基斜 面上，培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将氯 仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内 出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应作阴性对照。 当阴性对照试验呈阴性时，并为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性， 可判检出铜绿假单胞菌。 绿脓菌素阴性的培养物，应继续做以下试验。 硝酸盐还原产气试验 取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中, 培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。 42℃生长试验 取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9％无菌氯化钠溶液中,制成菌悬 液，再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面，立即置41℃±1℃水浴中培养24～48小时, 有菌苔生长者为阳性，否则为阴性。 明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内， 培养24小时，取出置冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，为阳性。 当为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性，绿脓菌素试验阴性，其硝酸盐还原产气试验、 42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判检出铜绿假单胞菌。 (4) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤） 培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性 对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。均培养18～24小时(必要时可延至 48小时)。阴性对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板 或甘露醇高盐琼脂培养基平板，培养24～72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时， 供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征,可判未检出金黄色葡萄球 菌。 表4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 ─────┬───────────────── 培养基 │ 菌 落 形 态 ─────┼───────────────── 卵黄高盐 │金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有 琼脂 │卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm ─────┼───────────────── 甘露醇高盐│金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有 琼脂 │黄色环，菌落直径0.7～1mm ─────┴───────────────── 如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2～3个菌落，分别接种于营养 琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取其培养物革兰染色，并作血浆凝固酶试验。 血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆①－无菌水(1:1)0.5ml，1支加入 被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培 养液或菌悬液0.5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或0.9％无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性 对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。阴性对照 管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和阴性 对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。 当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳 性时，判定为检出金黄色葡萄球菌。 结果判断 细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定， 应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。 细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时，应 从同一批号样品中随机抽样，复试2次，以3次结果平均值报告。 眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供 试品合格。 如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板生长细 菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定， 应判供试品不合格。 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应 判该供试品不合格。 ① 血浆的制备 以无菌注射器吸取灭菌的含5％枸橼酸钠的0.9％氯化钠溶液1ml, 用无菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时，徐徐放入 灭菌离心管中，离心，分离血浆，用灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中，置冰箱内备用。 临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌测试，证明血浆合格后，方可 用于试验。 表5 微生物限度标准 （单位：个/g或个/ml） ────────────┬────┬───────┬─────┬────────┬─── ─── 剂 型 │细菌数 │霉菌、酵母菌数│大肠杆菌 │金黄色葡萄球菌 │铜绿假 单胞菌 ────────────┼────┼───────┼─────┼────────┼─── ─── 丸剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 30000 │ 100 │ — │ │ 散剂 │ 30000 │ 100 │ — │ │ 口服兼外用 │ 30000 │ 100 │ — │ — │ — 阴道用 │ 100 │ 10 │ │ — │ — 颗粒剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 片剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 100 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 锭剂 │ 10000 │ 100 │ — │ — │ — 口服兼外用 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 煎膏剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 胶剂 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 糖浆剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 合剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 滴丸剂 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 胶囊剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 酒剂 │ 500 │ 100 │ — │ │ 外用 │ 500 │ 100 │ │ — │ — 酊剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 外用 │ 100 │ 100 │ │ — │ — 流浸膏剂与浸膏剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 软膏剂 │ 1000 │ 100 │ │ — │ — 用于烧伤、溃疡、创伤者│ 100 │ 10 │ │ — │ — 露剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 茶剂 │ │ │ — │ │ 不含糖 │ 10000 │ 100 │ │ │ 含糖 │ 1000 │ 100 │ │ │ 搽剂 │ 100 │ 100 │ │ │ 栓剂 │ 10000 │ 100 │ │ — │ — 用于溃疡、出血者 │ 100 │ 10 │ │ — │ — 滴鼻剂 │ 100 │ 10 │ — │ — │ — 滴眼剂 │ 100 │ — │ │ — │ — 气雾剂、喷雾剂 │ 100 │ 10 │ — │ — │ — ────────────┴────┴───────┴─────┴────────┴─── ──── 注：—表示每1g或每1ml不得检出。 说明 1.含动物及含脏器的制剂（包括提取物）还不得检出沙门菌。 2.用于创伤、溃疡、止血、深部组织及阴道的含原药材粉的制剂，还不得检出破伤风梭菌。 3.霉变、长螨者以不合格论。